1、1目的 保证GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪的正常使用。

(资料图片仅供参考)

2、 2 该SOP变动程序 本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室技术负责人，由季度组长会议决定。

3、如通过则公布实行。

4、 3 适用范围 GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪。

5、 4 使用方法 ⑴依次打开电脑显示器和电脑主机电源开关，进入Windows 2000界面。

6、 ⑵接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。

7、 ⑶按需要在电脑上设定一个新的运行版面和程序。

8、 ⑷推开滑门，将样品放入样品槽内，关上仪器滑门。

9、 ⑸运行程序，在反应结束后按Save键储存实验结果。

10、 ⑹关闭PCR仪电源开关。

11、 ⑺分析实验结果；发放临床报告。

12、 5 注意事项 ⑴仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。

13、 ⑵环境温度保持在23℃左右，湿度保持在60％左右。

14、 ⑶仪器应配备功率≥3000W的稳压器。

15、 ⑷仪器应定期清洁维护。

16、 ⑸仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。

17、 6 维护方法 6.1微软Windows 2000操作系统的维护 硬盘驱动器每月29日运行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或类似软件。

18、现以Norton为例： ①放入Norton Utilities光盘，运行安装（Setup）文件。

19、 ②安装完后取出Norton Utilities光盘，重新启动计算机 ③运行Norton Utilities软件，并启动其清理碎片/优化程序。

20、 ④运行完成后，检查以确信无严重错误记录，退出Norton Utilities。

21、 ⑤以后每次运行Norton Utilities软件中的清理碎片/优化程序就行了。

22、 6.2 7000 PCR扩增仪的维护 1.样品槽的清洁 样品槽每月29日进行一次清洁，如出现样品槽污染情况则随时清洁。

23、 操作方法： ①运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。

24、关闭仪器，等待10分钟。

25、 ②从样品槽移去样品架。

26、 ③在样品槽中加入少量95％乙醇，用棉签擦洗反应孔。

27、 ④用干棉签吸干乙醇。

28、 ⑤向里推动滑门，锁住，使样品槽升温到50℃，以蒸发掉多余的乙醇。

29、 2.热盖的清洁 热盖每月29日进行一次清洁，如有需要随时进行。

30、 ①运行25℃HOLD程序使样品槽温度达到室温。

31、关闭仪器，等待10分钟。

32、 ②逆时针旋转GeneAmp 7000光源检测器顶部旋钮。

33、向后推GeneAmp 7000光源检测器至滑轨距离的大约1/3处。

34、 ③GeneAmp 7000光源检测器滑轨上有缺口。

35、从这些缺口垂直抬起GeneAmp 7000光源检测器，小心侧放于仪器顶盖上。

36、不要从仪器取走热盖。

37、 ④用湿润的镜头纸清洁加热盖，待干。

38、 ⑤将GeneAmp 7000光源检测器重新安装回滑轨。

39、 6.3 GeneAmp 7000光路系统的维护 1.调准ROI参照条 调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。

40、不得由一般实验人员进行该项操作。

41、 ①推开滑门，在样品槽中放入荧光检测板。

42、 ②GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。

43、 ③从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。

44、 ④积分时间从512ms开始，用位置调整点，调节ROI的高度与右边线。

45、 ⑤逐渐增加积分时间，直到可以看到至少四个块（约4096ms）。

46、 ⑥调整最左侧位置调整点。

47、 ⑦减少积分时间到1024ms，调整上方与底部的位置调整点。

48、 ⑧减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和（约512ms），调节最右侧位置调整点。

49、如有需要用右上角拖动点调整图象的倾斜度（以左上角为中心旋转）。

50、 ⑨调节后的参照条宽度必须在ROI参照块间有小空隙。

51、 2.校正ROI光路 ROI光路校正每月29日进行一次，以便确信结果仍然是优化的。

52、 ①推开滑门，在样品槽中放入荧光检测板。

53、 ②GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。

54、 ③从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。

55、 ④点选Show ROI复选框。

56、每个样品孔周围出现一蓝色椭圆圈。

57、 ⑤点选Show Saturation复选框。

58、 ⑥设定积分时间为1024ms；打开卤素灯和光闸。

59、 ⑦点击LIVE按钮获取图象，然后在任何地方左击停止。

60、获取中等程度未饱和图象（无红色图象）。

61、 ⑧从Edit菜单中选择Calibrate ROIs每个孔都会选取合适的ROI，确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。

62、 ⑨图象太亮太暗都会出现错误信息，相应增加或减少积分时间，并重复上述第8步直到无错误信息出现。

63、 ⑩检查孔ROI位置，所有孔信息都应包含在96个ROI椭圆圈中。

64、如果没有，重复8和9步。

65、 3.检查样品槽的荧光污染 检查样品槽的荧光污染每月29日进行一次，如有需要随时进行。

66、 ①开启GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪电源。

67、 ②从Start菜单或桌面点选运行GeneAmp 7000 SDS管理软件。

68、 ③从样品槽中移去反应板。

69、GeneAmp 7000仪器滑门向前滑移盖住样品槽，并关紧。

70、 ④单击New Document建立一个新的GeneAmp 7000文件 ⑤点击instrument中的catibrate显示ROI inspector窗口 ⑥把Exposure Time调到最大，把Capture image From调到最敏感的FiterB点,单击Snapshot获取图象。

71、 ⑦减少积分时间，改变Capture image From中的A，B，C，D单击Snapshot 观察96孔中背景荧光。

72、如孔有显著荧光则表示该孔存在荧光污染。

73、 ⑧按照样品槽的清洁程序清洗样品槽4.更换卤素灯 仪器使用大约2000小时后应更换卤素灯。

74、 ①关闭仪器，冷却15分钟。

75、 ②将样品板放入仪器样品槽，关闭滑门。

76、在仪器的顶部向上打开灯舱门。

77、 ③拧下固定灯罩的螺丝，将灯罩向前滑移，使其从设备上取下。

78、 ④将旧灯泡向前滑移，使其从夹状支架上取下，并将灯泡从灯座上拔下。

79、 ⑤把新灯泡尾部的插杆插入灯座上的插孔，使二者连接起来。

80、 ⑥使灯的长轴与仪器前向平行（即竖直于地面），将新灯泡滑回灯位。

81、 ⑦在灯舱门处于打开状态下，打开仪器，确证在仪器运行时灯也能打开。

82、 ⑧盖上灯罩，拧紧螺丝，关上灯舱门。

83、 ⑨若新卤素灯不工作，GeneAmp 7000电源保险丝可能有问题。

84、 7 校准 GeneAmp 7000型荧光定量PCR仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师进行。

85、除与仪器厂家达成协议定期校准以外，以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。

86、 ⑴通过对室内质控图的分析，我们可以及时发现系统误差的出现。

87、经过分析排除了试剂和人员误差后，应怀疑是否仪器出现了检测偏差需要校准。

88、此时进行仪器状态效验实验确定是否需要进行仪器校准。

89、 ⑵仪器状态效验试验 ①使用标准化试剂作为效验试剂。

90、 ②在仪器处于校准状态下，由固定人员用标准化试剂对102、103、104、106标准品进行扩增实验。

91、该实验在两个月内应进行20次。

92、分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。

93、 ③每年6月、12月由固定人员进行上述实验，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和102标准品是否检出。

94、 ④当102标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。

95、如结果依然，联系厂家立即进行仪器校准。

96、 ⑤当仅有102标准品未检出时，检查实验全过程。

97、再次上机检测102标准品 两枚。

98、仍未检出联系厂家进行仪器校准。

99、 ⑥仪器经过校准后，重复该实验。

100、结果归入仪器档案。

101、标本前处理标准操作程序 1 目的 保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。

102、 2 该SOP变动程序 本文件的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报经室负责人决定。

103、如通过则公布实行。

104、 3 适用待处理标本范围 临床基因扩增实验室现行检测项目。

105、 4 标准操作程序 4.1 DNA血清类（例如HBV） ⑴双手戴上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次编号，收起验单，弃去手套。

106、 ⑵双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出1.5ml离心管，对应标本编号，置于离心管架上。

107、 ⑶将移液器调到50µl，先吸取50µlDNA提取液加入到编好号的离心管中。

108、然后吸取50µl血清，加入离心管中混匀，注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。

109、处理全部标本，然后将离心管插到水浴板上，用镊子放入水浴锅，沸水浴10分钟。

110、 ⑷水浴完成后用镊子将水浴板取出，转至4℃静置8～12小时，然后10000转 5分钟离心，取上清液2µl点样上机。

111、 ⑸收拾台面至准备状态。

112、 4.2 RNA血清类（例如HCV） ⑴双手戴上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次编号，收起验单，弃去手套。

113、 ⑵双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。

114、 ⑶先用5～40µl的移液器，吸取10µlRNA提取液A加入到编好号的离心管中，再用40～200µl的移液器吸取50µl 血清加入，最后用200～1000 µl移液器加入200 µlRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，冰上放置5分钟，然后6000转1分钟离心。

115、 ⑷去上清，留沉淀。

116、加入450µl 用DEPC水配制的75%的预冷乙醇洗涤沉淀，然后6000转1分钟离心，去上清。

117、相同方法再洗一次，吸干上清，65℃10分钟烘干。

118、 ⑸给烘干的沉淀中加入18 µl的反应液I，混匀，再加入2 µl逆转录酶，充分混匀，瞬时离心（3秒），放入温箱，37℃45分钟逆转录。

119、 ⑹逆转录后95℃3分钟高温灭活，瞬时离心（3秒），取5 µl上清立即点样上机。

120、 ⑺收拾台面至准备状态。

121、 4.3 分泌物类（例如CT） ⑴双手带上手套，从冰箱取出标本，将验单和试管依次对应编号，收起验单，弃去手套。

122、 ⑵双手换上新手套，用镊子（夹取灭菌物品专用）取出1.5ml离心管，对应标本编号后，置于离心管架上。

123、 ⑶用镊子拧下全部试管盖并依次置于实验台面上，试管对应放置于试管架上。

124、 ⑷向每只试管中缓慢加入1ml无菌生理盐水。

125、 ⑸用左手取试管于旋涡振荡器上充分振荡。

126、 ⑹将试管中的洗脱液全部转至相应离心管。

127、 ⑺将试管和离心管分别放回试管架和离心管盒中前一排对应位置，并用镊子将管盖对号盖回，把试管架放回冰箱。

128、 ⑻双手换上新手套，用左手将离心管全部配平，按顺序置于离心机中相应位置，以 12000转离心5分钟。

129、去上清，沉淀再加1ml生理盐水打匀，15000 rpm离心5分钟。

130、（如超过12管，则需分批进行）。

131、 ⑼离心完毕后，左手取出离心管，倾倒上液，再瞬时离心，右手取移液器将管内残液吸尽，只留下沉淀。

132、如无明显肉眼可见沉淀，则可在管内留下约50µl液体。

133、 ⑽依次向管中各加入50µlDNA提取液，此时移液器应与管壁约成30度角，吸头抵至沉淀上方靠管壁处，来回抽吸，将沉淀与DNA提取液混匀。

134、 ⑾将加入DNA提取液的标本沸水浴10分钟。

135、 ⑿将沸水浴后的标本放置至室温，并将其放入4℃冰箱中6～8小时保证充分裂解。

136、 ⒀离心标本10000 转5分钟。

137、 ⒁换上新手套，取上清液2µl点样上机。

138、 ⒂收拾台面至准备状态。

139、 4.4痰液类（例如TB） ⑴取晨痰加入4倍体积4％氢氧化钠待其充分液化(30分钟)，液化过程中，振荡2～3次，如痰液粘稠，可延长液化时间。

140、 ⑵取1 ml消化液加入离心管，10000转离心5分钟 ⑶弃上清留沉淀，加入1ml生理盐水洗涤，10000 转 5分钟离心。

141、 ⑷重复⑶操作，留沉淀，加入50µlDNA提取液，混匀。

142、 ⑸沸水浴10分钟，4℃放置8～12小时。

143、 ⑹10000 转5分钟离心，取上清2µl点样上机。

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